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支链氨基酸可促进晚期肝硬化患者髓样树突状细胞的成熟和功能
http://www.ganbingzixun.com     点击数:1133     更新时间:2010-08-03    【查看评论
硬化患者髓样树突状细胞的成熟和功能
徐玉敏 谢青
上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科


【据《Hepatology》2009年第6期报道】题:支链氨基酸可促进晚期肝硬化患者髓样树突状细胞的成熟和功能(作者Kakazu E等)
众所周知,肝硬化患者肝脏的基本功能(如解毒等)障碍,常因缺乏合适治疗而进展为失代偿肝硬化。由于免疫功能低下,患者常会发生院内感染,如自发性腹膜炎或肺炎。失代偿肝硬化患者会出现糖、蛋白质、脂肪、维生素和矿物质的代谢障碍,以及血浆氨基酸比例失衡:支链氨基酸(BCAA)减少而芳香氨基酸(AAA)增加。临床上已经发现,口服BCAA可改善患者一般情况,阻止肝衰竭进行性发展,代偿性肝硬化患者口服BCAA可防止肝癌的发生。
氨基酸是各种代谢的基础,可激活与胰岛素协同的营养素敏感的信号途径,mTOR (the mammalian target of rapamycin) 信号途径最具代表性。这个信号途径调节蛋白质合成,是细胞生长增生的主要效应器。mTOR下游效应分子的磷酸化被雷帕霉素抑制,而被BCAA(尤其是亮氨酸)激活。细胞外氨基酸水平对免疫系统的影响目前知之甚少。Kakazu等曾报道(J Immunol 2007;179:7137-7146)细胞外BCAA,尤其缬氨酸可调节单核细胞来源的树突状细胞(DC)的成熟和功能。DC是专职抗原递呈细胞,激活天然免疫和获得性免疫。未成熟DC迁移到淋巴组织,将抗原肽递呈给初始T细胞,而成熟DC特征性地表达CD83,通过产生免疫调节因子(如IL-10、IL-12),可快速激活其他如NK和NKT等天然免疫细胞。已有多项研究报道肝硬化存在免疫异常,如:网状内皮系统功能下降、中性粒细胞功能异常、血清补体减少等,导致肝硬化患者易于发生细菌感染和扩散。已知肝硬化患者DC功能障碍,然而关于肝硬化患者免疫细胞反应特别是DC细胞受抑制的原因目前尚不清楚。

Kakazu等进行该项研究目的在于观察晚期肝硬化患者中氨基酸不平衡对DC功能的影响。他们选择早晨空腹的25例健康志愿者、14例慢性肝炎、60例肝硬化患者,其血浆氨基酸浓度分别经高效液相层析(HPLC)检测,磺基水杨酸加入血浆致终浓度5%,标本置冰上15 min,然后离心去除沉淀的蛋白质,上清液用JLC-500/V系统分析氨基酸含量。晚期肝硬化43例,Child分级B或C级,其中22例丙肝、5例PBC、酒精肝3例、非酒精脂肪肝3例、慢性乙型肝炎2例、PSC 2例、HBV+HCV混合感染1例、自身免疫性肝炎1例、Wilson’s病1例、Budd-Chiari综合征1例、隐源性肝硬化2例。,相当于健康志愿者血氨基酸水平的无血清培养基,简称为HCM,相当于晚期肝硬化患者的简称为ACM。除氨基酸外,培养基中其他成分一样。在两种培养基中培养PBMC 48 h,并测培养基中氨基酸浓度,发现在培养前后氨基酸浓度无差别。PBMC活率用Annexin V检测,死亡细胞PI染色。他们发现在HCM、ACM中培养的PBMC的存活率与在完全培养基(CCM)和X-VIVO10中的相同。同时他们选了15例肝硬化患者做体外研究,15例均为住院患者,与43例晚期肝硬化患者的临床和实验室检查特征(年龄、AST、ALT、TB、ALB、PT/INR、PLT、Child评分、MELD评分等)没有显著差异,试验前均签署知情同意书。
BDCA+ DCs的成熟与MoDC的产生:PBMC通过密度梯度离心从肝硬化患者(LC)和健康对照(HC)者外周血分离,血树突细胞抗原阳性树突细胞(BDCA+ DCs)和CD14阳性单核细胞用免疫磁珠方法从PBMC分离获得。BDCA1+DCs 以2.5×105个细胞/孔的密度在96孔板中培养48 h,在培养基中加1000 U/mL GM-CSF 和500 U/mL (hu)的IL-4。培养24h后用500 ng/mL LPS或30 μg/mL polyI:C刺激DCs。单核细胞在加有GM-CSF和 IL-4 的CCM培养基中以3.0×105个细胞 /孔的密度培养6 d,第6天,换培养液,把CCM换成加有poly(I:C) 的HCM或ACM继续培养48 h。
    收集DC细胞,用FITC或PE单克隆抗体(抗人CD14, CD40, CD83, CD86, CD98, HLA-DR等)标记,用FACS Calibur 流式细胞仪,采用CellQuest 程序分析表面标记的表达。
     为了检测DC的吞噬力,在2.5×105的 DC中加1 mg/mL FITC-dextran(右旋糖酐),37°C孵育30 min。对照组DC予同样剂量的FITC-dextran(用右旋糖酐分析细胞吞噬作用),4°C 孵育30 min。DC经孵育结束并洗涤后,用FACS进行检测分析。
     细胞因子分析:BDCA1+DCs 以2.5×105个细胞/孔的密度在96孔板中培养48 h,在培养基中加1 000 U/mL GM-CSF 和500 U/mL (hu)的IL-4。培养24 h后用500 ng/mL LPS或30 μg/mL polyI:C刺激DCs。48 h后收集上清液,立即用细胞因子ELISA试剂盒检测IL-12 (p40+p70) 和IL-10。至于PBMC产生的IFN-γ的检测:PBMC以2.5×105个细胞 /孔的密度在HCM或ACM中培养48 h,再以5.0×105个细胞/孔的密度在自体血浆中培养12 h,用细胞因子ELISA试剂盒检测IFN-γ。
    混合淋巴细胞反应(MLR):BDCA1+DCs 以1.0×105个细胞/孔的密度在含HCM或ACM培养基的96孔板中培养48 h,在培养基中加有GM-CSF 和IL-4。在培养24 h的时候,加LPS 或 poly(I:C)以使未成熟DC诱导成熟。被照射的DCs (3000 Rad)的协同刺激能力用one-way MLR 检测,2×105个细胞/孔同种异体CD4+淋巴细胞(用免疫磁珠从PBMC分离得到),细胞共培养7 d,细胞增生情况用MTS法及CellTrace CFSE细胞增生试剂盒检测。
免疫印迹检测:DC细胞以3.0×105cells/well 密度在96孔板中培养,200μL 培养基中加GM-CSF和IL-4孵育24 h,接着DC细胞用poly(I:C)刺激1 h。然后收获DC细胞,用CelLyticTM-M哺乳动物细胞裂解/抽提剂裂解,离心,蛋白浓度用改良Lowry蛋白检测试剂盒检测。相同的蛋白量经SDS-PAGE电泳后转膜至PVDF。经洗膜和封闭后,与兔多克隆一抗(PI3K、phospho-PI3K、mTOR、p70 S6K、phospho-p70 S6K)结合,再经HRP二抗结合,ECL显色。
晚期肝硬化患者口服BCAA及体外细胞因子产量检测:早晨检测口服BCAA前后(30、60、120、180 min)健康对照者和肝硬化患者的血浆氨基酸浓度,BCAA颗粒剂(LIVACT)的组成成分是:缬氨酸1.144 g、亮氨酸 1.904 g和异亮氨酸0.952 g。血浆氨基酸浓度用HPLC检测。来自患者的PBMC用LPS 或poly(I:C) 刺激12 h,12 h后复苏血浆,用ELISA测IFN-γ。
研究结果发现:
1、与晚期肝硬化患者相同的血氨基酸浓度有损于mDC的成熟:他们首先检测了HCM和ACM培养基中PBMC的细胞因子产量,ACM中经poly(I:C)刺激的IFN-γ的产生分泌明显减少。接着他们在HCM和ACM中培养BDCA+ DC(纯度大于90%) 48 h,通过流式细胞仪检测DC表型。ACM中CD83和CD86的表达比HCM的明显减少。HLA-DR的表达在ACM中呈减少趋势。ACM中BDCA+ DC的IL-12 产量明显减少,HCM与ACM中DC的IL-10产量没有差异。流式细胞仪分析发现HCM与ACM中BDCA+ DC和MoDC 的FITC-dextran 摄取量也没有差异。通过MTS及CFSE检测发现,ACM培养的BDCA+ DC的协同刺激能力明显下降。
他们检测了HC和LC之间BDCA+ DC的频数(frequency),晚期肝硬化患者外周血DC的frequency明显比HC和早期肝硬化者的低(见图1)。LC患者在加刺激物前后BDCA+ DC的表型检测,发现分离的表达CD40、CD83、CD86、HLA-DR的未成熟DC的平均荧光强度(MFI),在HC与LC之间没有区别。加了刺激物后LC患者DC的CD83和HLA-DR表达量比健康对照者的明显减少。在ACM中的DC的CD83和CD86的表达比HCM中的减少。
 
2、BCAA浓度增加促进BDCA+ DC分泌IL-12:体内研究中已证实,随着Child分级血BCAA浓度减少而AAA浓度增加(色氨酸除外)。基于此,为探寻哪一种氨基酸最影响BDCA+ DC的功能,他们检测了HCM、ACM及加了800 nmol/mL单氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)的ACM中的DC的细胞因子产生情况,有趣的是加了缬氨酸或亮氨酸的ACM中刺激后DC的IL-12产生量明显增加,DC的共刺激能力也增加。但在ACM、加了异亮氨酸的ACM、加AAA的ACM之间没有区别。接着,他们检测了不同培养基(CCM、无 BCAA、无缬氨酸、无亮氨酸、无异亮氨酸)中BDCA+ DC的表型(CD14和CD83) ,在CCM、无亮氨酸及无异亮氨酸培养基中,DC表型相同,而在无 BCAA和无缬氨酸培养基中DC 的CD83表达显著减少。无缬氨酸培养DC 2 d后,加缬氨酸入培养基再培养24 h,成熟DC的比例比原来明显增多。为了更能反映实际体内环境,他们用自体血浆或加有100 nmol/mL缬氨酸的自体血浆诱导LC患者的DC成熟,诱导12 h,在加有缬氨酸的自体血浆中诱导成熟的DC的协同刺激能力和IL-12产生能力均增强。
3、晚期肝硬化患者的血浆氨基酸浓度下调BDCA+ DC的mTOR/S6K 信号通路:他们假设晚期肝硬化患者的血浆氨基酸不平衡影响DC的mTOR/S6K 信号通路及DC的成熟化,在有雷帕霉素的HCM中,CD14-/CD83+的成熟DC 的比例比没有雷帕霉素的高。在所有培养基中,BDCA+ DC表达相同水平的总PI3K、磷酸化PI3K、mTOR、p70 S6K和β-actin。有趣的是,ACM中培养的DCs表达的磷酸化p70 S6K比HCM中的低,ACM中DCs的磷酸化p70 S6K的表达可通过加入400 nmol/mL BCAA而部分恢复。 分离的未成熟 BDCA+ DC表达中等量的CD98,可调节氨基酸转运功能。在HCM与ACM,CD98表达未见明显差异。
4、口服BCAA可促进晚期肝硬化患者的PBMC产生IFN-γ:为了观察BCAAs体外对免疫反应的影响,健康志愿者口服30 min后血浆BCAA浓度达高峰,而晚期肝硬化患者口服60 min后血浆BCAA浓度达高峰,随后的3 h AAA逐渐减少。在口服前后60 min,他们用自体血浆刺激晚期肝硬化患者的PBMC,有趣的是,用LPS刺激PBMC,口服BCAA后者IFN-γ产生的量多。

作者Kakazu等在这项研究中制造了2种无血清培养基(HCM和ACM)以代表人的生理环境,并定量检测了血浆氨基酸谱。首先,他们发现晚期肝硬化患者血浆氨基酸不平衡使PBMC产生IFN-γ障碍。IFN-γ是一种二聚化的可溶性细胞因子,是唯一的一种II 类干扰素,由Th1细胞、DC和NK细胞分泌产生。虽然初始T细胞向Th1或Th2分化受多种因素影响,但由APC,尤其是DC所产生的IL-12p70 (IL-12)最关键。因此,他们设想PBMC产生IFN-γ障碍导致DC功能障碍。与设想一致的是,ACM中DC的成熟及产生IL-12的能力受损坏。他们还通过MTS and CFSE方法证实 ACM 中DCs 的协同刺激能力受限。以往的研究认为肝硬化患者IL-10增加,以及高IL-10低HLA-DR表达与免疫失调有关。但在这项研究中,ACM与HCM中DC的IL-10分泌无差异。这可能与以下有关:(1)免疫细胞的刺激期不同(前者来自活体,而这项研究在体外); (2)细胞来源不同 (前者是单核细胞,而此项研究是DC;(3)除氨基酸外影响IL-10产生的其他因素。而且肝硬化患者ACM中DC的CD83 和CD86表达比HCM 中的低。在同样的培养基中,LC患者DC的CD83、CD86、HLA-DR的表达比健康对照者的低。总之,在晚期肝硬化中不仅DC本身,细胞外环境也影响DC的成熟。
    他们还检测了HCM和ACM中哪些氨基酸更影响DC的功能,发现BCAA尤其缬氨酸和亮氨酸可增加 BDCA+ DC的协同刺激能力和IL-12的产生。 这也证实了他们先前的研究。单一氨基酸力量比较微弱,可联合多种氨基酸以增强作用。
该项研究发现HCM和ACM中DC的CD98表达没有差异,CD98 可调节轻链的表达和分布,调节氨基酸的转运功能。CD98hc在增生的淋巴细胞和其他快速生长的细胞上高表达。作者他们还检测了晚期肝硬化患者血浆氨基酸不平衡是否影响DC的mTOR/S6K信号途径。最近,一些研究报道DC中PI3K介导对IL-12的负反馈调节,在LPS刺激的DC中雷帕霉素增强IL-12的产生。而此项研究发现即使mTOR信号减少,ACM中被刺激过的BDCA+ DC还是损害了IL-12的产生。这种矛盾使人推理到这种可能:氨基酸不平衡不仅影响mTOR信号途径,而且还影响到其他诸如GSK3或NF-kB信号途径,这个问题有待将来研究证实。
作者观察了血浆氨基酸水平是否增强晚期肝硬化患者的免疫反应。BCAA颗粒一直被用于有效缓解晚期肝硬化患者的低蛋白血症和肝性脑病。他们分析了口服后的药代动力学,口服后,健康对照者30 min BCAA达最高浓度,对比而言,晚期肝硬化患者则要到60 min达高峰。这种差别可能是由于患者的氨基酸吸收障碍。在离体研究,他们不能用培养基来分析PBMC中DC的功能,因为培养基中的氨基酸浓度影响功能。因此,他们用自体血浆刺激细胞,分析短期内的功能变化。结果发现晚期肝硬化患者口服BCAA可增强PBMC产生IFN-r的能力。这点是否可应用于临床降低肝硬化感染败血症的发生或用于病毒性肝炎抗病毒,还需要做前瞻性、随机、对照临床试验,并要长期随访。此项研究至少已经发现,细胞外氨基酸,尤其BCAA影响免疫系统功能,晚期肝硬化患者血浆氨基酸不平衡使DC成熟障碍,并使PBMC或DC的炎症细胞因子产生受限。
    此项研究有助于推动将来有关于晚期肝硬化营养治疗改善免疫功能方面的研究。

                                           

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