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阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎的耐药性分析
http://www.ganbingzixun.com     点击数:1651     更新时间:2010-08-03    【查看评论
曾爱中 卢萍 邓蕙 蔡素芳 杨春 辛小娟 郭进军 李青岭 邓小燕 黄爱龙

【摘要】目的   探讨阿德福韦酯治疗慢性乙型肝炎耐药性产生的原因。 方法   从阿德福韦酯Ⅲ期临床试验中筛选出 30 例原发治疗失败或继发耐药患者,应用巢式逆转录聚合酶链反应扩增 HBV RT 区,比对 RT 区核苷酸及氨基酸序列,找出变异位点。 结果   30 株阿德福韦酯治疗失败者中有 21 HBV 表现出原发性耐药 , 其中 5 株具有多态性位点 rtN118H (23.8%, 5/21) 。另外 9 株发生继发性耐药,继发耐药毒株在 RT 保守区( C 结构域 rtM207V )和非保守区多个区域均有变异。没有发现典型的 rtN236T rtA181V/T 突变。 结论   多态性位点 rtN118H 与阿德福韦酯原发耐药可能有关。 HBV RT C 结构域 rtM207V 变异及其他处于非保守区的变异可能与 HBV 继发性耐药有关,天然耐药准种的存在可能是 HBV 对阿德福韦酯迅速耐药 ( 继发性 ) 的基础。上述结论有待进一步表型验证实验加以证实。

【关键词】肝炎,乙型,慢性; 阿德福韦酯; 耐药; 准种

 

Dissection of mechanism for the adefovir dipivoxil resistance in chronic hepatitis B patients     ZENG Ai-zhong, LU Ping, DENG Hui, CAI Su-fang, YANG Chun, XIN Xiao-juan, GUO Jin-jun, LI Qing-ling, DENG Xiao-yan, HUANG Ai-long. Department of Infectious Disease, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Email: aizhong9@yahoo.com.cn

Abstract Objective     To explore the mechanism for adefovir dipivoxil (ADV) resistance occurred in chronic hepatitis B patients of a series of phase III clinical trails. Methods     30 resistant HBV strains were selected out from 177 cases of ADV treated chronic hepatitis B patients. HBV polymerase RT region were amplified by nested PCR and analyzed with the standard neucleiotide sequence of HBV strains deposited in GeneBank. Results     21 out of 30 HBV strains were primary resistant strains, among them 5 HBV strains (23.8%, 5/21) had the polymorphism site of rtN118H. While the other 9 HBV strains showed secondary resistance, variations in conservative region C (rtM207V) and other non-conservative regions were found. The classic mutation sites such as rtN236T and rtA181V/T were not found. Conclusions     Polymorphism site of rtN118H might be responsible for HBV primary resistance to ADV therapy. rtM207V variation in HBV RT C domain and other variation sites might play a role in HBV secondary resistance to ADV treatment, and natural resistant quasispecies may be the basis for the ADV quick resistance. These conclusions await further confirmation by phenotype test.

Key words Hepatitis B, chronic;   Adefovir dipivoxil;   Resistance;   Quasispecies

核苷类似物抑制 HBV 复制疗效确切可靠,能够逆转早期肝纤维化,阻止或降低肝硬化或 HCC 发生的风险。核苷类似物长期抗 HBV 治疗所面临的最重要问题之一是 HBV 出现的耐药性 [1] 。尽管一系列其他因素,包括个体代谢差异、药物不良反应、临床用药方式不当、患者依从性差等因素影响慢性乙型肝炎的治疗效果,但 HBV 耐药仍然成为治疗失败的最重要因素 [2]

我们在对阿德福韦酯( adefovir dipivoxil ADV )Ⅲ期临床试验 177 例慢性乙型肝炎患者资料分析后筛选出 30 例原发治疗失败或继发耐药患者,通过分析耐药 HBV 毒株 RT 区核苷酸及氨基酸序列,并与阿德福韦治疗前的野毒株序列进行比对,初步揭示 ADV 治疗前后 HBV RT 保守区和非保守区变异与 ADV 耐药的关系。

资料与方法

一、资料

1 .研究对象: 2005 9 -2007 8 月在重庆医科大学附属第一医院感染科门诊和住院部应用 ADV (每天口服 1 次、每次 10mg 、疗程 1 年)治疗的 177 例慢性乙型肝炎患者,其中男 142 例,女 35 例,平均年龄( 33.6 ± 8.5 )岁。筛选标准、用药方案及检测指标参见文献 [3] ,血清标本于 -80 存放。

2 .主要试剂及仪器参见文献 [4]

二、方法

1 .血清标本 HBV DNA 提取:采用罗氏公司 High pure viral nucleic kit 试剂盒 , 操作按说明书进行。提取的 HBV DNA 溶于 50 μ l 洗脱缓冲液中 -80 保存备用。

2 HBV DNA 滴度测定和基因型检测参见文献 [3] 。根据 Locarnini 原发性耐药及继发性耐药的定义筛选出原发耐药和继发耐药毒株 [5]

3 ADV 治疗前后耐药 HBV RT 区巢式逆转录聚合酶链反应(巢式 PCR )扩增、测序:根据 HBV 标准株 [ 编号 D00330 Ba 亚型( adw ),编号 AB073858 Bj 亚型和编号 AB 033556 C 型( adw ] B C 基因型 RT 区保守序列,自行设计二对引物。外引物:正向为 hbvRTP1 nt13 39 5 -CCACC AAACTCTTCAAGATCCCGGAGT-3 ′,反向为 hbvRTP4 nt1199 1181 5 -GTTGGGTCAGC AAACACTTGGCA-3 ′;内引物 : 正向为 hbvRTP2 nt62 90 5 -GGTGGCTCCAGTTCMGGAAC AGTGM(G/A)CCC-3 ′,反向为 hbvRTP3(nt1061 1036) 5 -GGCATTAAAGCAGGATA TCCACATTG-3 ′。 PCR 的反应体系: 5 × PS 缓冲液(含 Mg2+ 5 μ l dNTPs (2.5mmol/L) 2 μ l 、引物( 10 μ mol/L )各 1 μ l PrimeStarDNA 聚合酶 0.25 μ l HBV DNA 模板 2 μ l 、灭菌双蒸水 14 μ l 。反应条件: 94 5min 94 30s 55 15s 72 80s, 35 个循环。第 2 PCR 反应以第 1 PCR 产物 1 μ l 作为模板、反应体系和反应条件与第 1 PCR 相同。通常先用外引物行第 1 PCR 扩增 , 如无阳性条带 , 则再用内引物行第 2 轮巢式 PCR 扩增。引物由上海生工生物工程有限公司合成。取 PCR 产物 3 μ l 进行琼脂糖凝胶电泳,对扩增产物进行初步鉴定。 PCR 产物纯化后,经 ABI PRISM 3100 基因测序仪分析和 Sequence analysis 5.1.1 软件读取测序结果,利用 http://workbench.sdsc.edu 网站对 ADV 耐药患者 HBV RT 区核苷酸和氨基酸序列、 ADV 治疗前患者 HBV RT 区序列及 GenBank 3 条标准序列进行比对,寻找 HBV RT 区内核苷酸变异。

   

一、 30 例原发治疗失败或继发耐药患者 HBV DNA 滴度测定及基因型分析

治疗 3 个月内, HBV DNA 滴度下降≤ 1log10IU/ml 的有 21 株即为原发耐药株 ( 也包括抗病毒治疗过程中 HBV DNA 值始终未下降到 4log10IU/ml 以下者 ) 。经过间隔 1 个月的连续 2 次检测证实,在治疗有效( HBV DNA 值下降≥ 1log10IU/ml )的情况下出现病毒复制指标反弹, HBV DNA 上升≥ 1log10IU/ml 的有 9 株即为继发耐药株。总共 30 HBV 耐药毒株中 B 基因型占 24 , C 基因型 6 株。其中 21 例原发治疗失败患者感染 B 基因型 HBV 18 , C 基因型 3 株,另 9 例继发性耐药中 B 基因型 6 , C 基因型 3 株。

二、 2 例典型 ADV 继发耐药毒株病毒学突破、临床生物化学突破与治疗时间的关系

9 例继发耐药患者中, 2 例较为典型,我们对继发耐药毒株感染患者病毒学突破、生物化学突破及其与治疗时间的关系进行了分析。其余 7 例,变化类似。

1. 样本号 21 患者血清 HBV DNA ALT 与治疗时间的关系:该患者治疗前 HBV DNA 为( 2.76E+07 )拷贝 /ml ALT 96U/L ;治疗 12 周时 HBV DNA 降至( 6.86E+03 )拷贝 /ml ALT 降为 33U/L ;治疗 24 周时, HBV DNA 反弹,上升为( 7.78E+05 )拷贝 /ml ,此时 ALT 30U/L, 36 周时 HBV DNA 为( 3.24E+05 )拷贝 /ml ALT 反弹上升至 116U/L ;继续治疗至 48 周时 HBV DNA 为( 1.53E+05 )拷贝 /ml ALT 127U/L ( 1)

2. 样本号 52 的患者血清 HBV DNA ALT 与治疗时间的关系:该患者治疗前 HBV DNA 为( 1.30E+08 )拷贝 /ml ALT 95U/L ;治疗 8 周时 HBV DNA 降至( 9.70E+05 )拷贝 /ml ALT 降至 55U/L 12 周时 HBV DNA 为( 1.20E+06 )拷贝 /ml ALT 49U/L ;治疗 24 周时 HBV DNA 反弹上升至( 2.50E+07 )拷贝 /ml ALT 43U/L ;到 48 周时 HBV DNA 为( 6.10E+06 )拷贝 /ml ,此时 ALT 反弹升至 142U/L ( 2)

三、 ADV 治疗前后耐药毒株 RT 区巢式 PCR 扩增及变异位点分析

1. 部分原发或继发耐药标本 ADV 治疗前后 RT PCR 扩增:对 10 株耐药毒株感染者治疗前( 0 周)及治疗后( 48 周)临床标本 HBV DNA RT PCR 扩增,扩增产物约为 1100bp (图 3 )。

2. 部分原发或继发耐药毒株 RT 区变异位点分析:( 1 HBV RT 区多态性位点筛选:共有 6 HBV 治疗前、治疗 24 周及 48 周时第 481 位核苷酸 (nt 481) 均为 c Ba Bj 亚型为 a , 与标准株比较,该位点出现 rtN118H aat cat )变异。提示 rt118H 为多态性位点。其中 5 株表现出原发性耐药。具有多态性位点 rtN118H 的耐药毒株占原发性耐药株的 23.8% 5/21 )。其他多态性位点有 rtM 271L nt940 atg gtg, 14.3%, 3/21 )和 rtY 141F 14.3%, 3/21 )。( 2 HBV RT 区变异位点筛选:样本号 21 52 75 80 等具有典型继发性耐药的特点,在发生 HBV DNA 反弹前己出现了某些位点核苷酸的变异。以 21 号标本为例,在治疗前核苷酸第 1042 ( 测序图中为 nt821 ) 主要为碱基 T, 有极少碱基 C <T 碱基数的 5% );第 12 周时( nt773 位) , 碱基 C 大幅上升(为 T 碱基数的 50% );第 24 周( nt764 位) , 碱基 C 含量超过碱基 T 含量 , 出现 rtY305H 变异; 48 周时( nt778 位)碱基 C 仍略占优势(图 4 )。

   

Locarnini [5] 国际专家组对核苷类似物治疗失败的定义作了规范:在排除患者依从性、代谢性、和胃肠吸收等因素外,原发性耐药是指治疗 3 个月内, HBV DNA 检测值下降≤ 1log10IU/ml 。继发性耐药是指经过间隔 1 个月的连续 2 次检测证实,在治疗有效( HBV DNA 下降≥ 1log10IU/ml )的情况下出现病毒复制指标反弹, HBV DNA 上升≥ 1log10IU/ml 。侯金林和孙剑 [6] 补充认为原发性耐药也应包括抗病毒治疗过程中 HBV DNA 从未下降到 4log10IU/ml 以下者。

根据该定义,我们从 177 ADV 治疗的慢性乙型肝炎患者中筛选出 30 ADV 耐药株 HBV ,其中 21 株( 11.9% )为原发性耐药、 9 5.1% )株为继发性耐药。耐药率明显高于国外临床研究资料。但最近也有关于 ADV 治疗失败率高达 31.5% 2 年)的报道 [2] 。本研究结果显示,继发性耐药患者在治疗过程中出现了血清 HBV DNA ALT 反弹, HBV DNA 常常反弹在先, 1 3 个月之后 ALT 开始上升。这些现象表明肝脏病变的活动与 HBV 复制密切相关,可能与大量病毒抗原释放激活免疫反应致肝细胞损害有关。

Schildgen [7] 发现多态性位点( rtI233V )与 3 ADV 原发性耐药有关。体外实验证实含 rtI233V 的变异株与野生型毒株相比, ADV 50% 抑制浓度增加了 6 12 倍。本研究结果显示在 21 例阿德福韦原发耐药患者中有 5 例( 23.8% )患者具有新的多态性位点 rtN118H 。这些患者对 ADV 治疗缺乏反应,临床病毒学及生物化学指标没有任何改善,提示多态性位点 rtN118H ADV 原发耐药可能有关。多态性位点 rtM 271L rtY 141F 各占 14.3% 。这些多态性位点尤其是 rtN118H 位点是否确与 ADV 的天然(原发)无反应性有关,值得进一步研究。

本研究中有 1 例患者在治疗初始时 nt1024 位即存在 T C 两种核苷酸 , 治疗过程中核苷酸 C 逐渐上升, HBV DNA 开始反弹, 24 周时则超过核苷酸 T ,出现 rtY305H 变异,变异株成为优势株, HBV DNA 也达到峰值,此时血清 ALT 开始升高;由此推测该例患者至少存在两个以上准种感染,其中一个含 nt1024 C 的准种经 ADV 筛选后从劣势株迅速成长为优势株 (12 24 ) ,导致对 ADV 耐药。与此类似, 1 例患者在治疗 48 周时出现 rtA222T rtH126Y 变异; 1 例患者在治疗 36 周时出现 rtM207V 变异。因此,我们推测天然耐药准种的存在是对 ADV 迅速耐药的基础。这种推论仍然需要对 rtY305H 等变异进行表型确证实验。

我们发现耐药 HBV RT 区多个区域均有变异 : 如聚合酶 C 保守区 rtM207V 变异及其他非保守区的变异(如 rtY305H rtK149Q 等),这些变异均有可能通过改变聚合酶的空间构像或通过影响调控序列而增强变异株的复制力,从而表现出致病性的增强和耐药性的产生 [8] 。张继明等 [8] 72 例拉米夫定临床耐药患者进行 RT 区分析 , 发现其中 12 例耐药患者 HBV 并无典型 YMDD 变异 , 但在非保守区发现其他变异位点,他们认为拉米夫定耐药与这些非保守区变异位点有关。

我们在全部 ADV 耐药株中均没有发现典型的 rtN236T rtA181V/T 突变,究其原因可能是:治疗时间偏短,只有 48 周。目前文献报道 rtN236T rtA181V/T 出现的最快时间为 52 周,因为 rtN236T rtA181V/T 是完全新出现的突变,需要较长的筛选时间,而不是象我们研究中预先存在的准种那样,能被 ADV 较快的筛选出来( 12 24 周)。这些差异可能与国内外 HBV 基因型构成不同有关,国外主要是 A D 型,国内以 B C 型为主。 B C 型对干扰素、核苷类药物的疗效要差于 A D 型。也可能与国内存在乙型肝炎不规范治疗导致准种产生过多有关。

HBV 的致病性和耐药性除了与其自身特点有密切关系外,还与宿主因素密不可分,与药物本身的特性也有重要关系。

最近发现了几个宿主介导的对核苷(酸)类似物耐药的机制 [9] 。碱基及核苷(酸)类似物通过两个不同家族外排泵外排增加: P 糖蛋白 - Pgp )和耐多药蛋白( MRP 1-9 )。过度表达两种透膜蛋白 MRP4 MRP5 时,肝细胞对核苷类似物细胞毒作用的耐受性增加。体外试验也观察到 MRP4 MRP5 能够将阿德福韦和替诺福韦泵出到胞外。 Chou [10] 证实在体外人细胞系表达一种新近鉴定的广泛存在于细胞质中的核酸酶( cN-1 )时,该细胞系对双脱氧胞苷及其衍生物的细胞毒作用的耐受性提高了 300 倍。

总之, HBV 对核苷(酸)类似物的耐药是病毒、宿主和药物等多种因素相互作用的结果。本项研究提示多态性位点尤其是 rtN118H ADV 的天然无反应性(原发耐药)可能有关,而治疗后 HBV DNA RT 变异 ( 准种筛选 ) 可能是导致 ADV 快速耐药的重要因素(继发耐药)。宿主因素在耐药性产生中起什么作用,也有待进一步深入研究。

     

[1]Kao JH, Chen DS. Global control of hepatitis B virus infection. Lancet Infect Dis, 2002, 2: 395-403.

[2]Osiowy C, Villeneuve JP, Heathcote EJ, et al. Detection of rtN236T and rtA181V/T mutations associated with resistance to adefovir dipivoxil in samples from patients with chronic hepatitis B virus infection by the INNO-LiPA HBV DR line probe assay (version 2). J Clin Microbiol, 2006, 44: 1994-1997.

[3]Zeng AZ, Deng H, Yang C, et al. Hepatitis B virus genotype-associated variability in antiviral response to adefovir dipivoxil therapy in Chinese Han population. Tohoku J Exp Med, 2008, 216: 205-211.

[4]Zeng AZ, Huang AL, Guo JJ, et al. Genotyping 238 HBV strains usin type-specific primer PCR combined with type-specific nucleotide analysis. Zhonghua Ganzangbing Zazhi, 2008, 16: 84-87. (in Chinese)

曾爱中,黄爱龙,郭进军,等 . 乙型肝炎病毒基因的型特异引物结合型特异核苷酸分析 . 中华肝脏病杂志 ,2008,16:84-87.

[5]Locarnini S, Hatzakis A, Heathcote J, et al. Management of antiviral resistance in patients with chronic hepatitis B. Antivir Ther, 2004, 9: 679-693.

[6]Hou JL, Sun J. Update to drug-resistant of chronic hepatitis B patients treated with nucleotide analogue. Zhonghua Chuanranbing Zazhi, 2006, 24: 145-147. (in Chinese)

侯金林 , 孙剑 . 核苷类似物抗乙肝病毒治疗后耐药新认识 . 中华传染病杂志 ,2006,24:145-147.

[7]Schildgen O, Helm M, Gerlich W. Nonresponse to adefovir: host or virus dependent? J Clin Virol, 2006, 37: 327-328.

[8]Zhang JM, Yin YK, Lu Q, et al. Analysis of partial RT region sequences of lamivudine-resistant HBV strains from patients with chronic hepatitis B. Ganzang, 2003, 8: 28-31. (in Chinese)

张继明 , 尹有宽 , 卢清 , . 拉米夫定耐药 HBV 毒株的 RT 区序列分析 . 肝脏 ,2003,8:28-31.

[9]Wijnholds J, Mol CA, van Deemter L, et al. Multidrug-resistance protein 5 is a multispecific organic anion transporter able to transport nucleotide analogs. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97: 7476-7481.

[10]Chou KM, Kukhanova M, Cheng YC. A novel action of human apurinic/apyrimidinic endonuclease: excision of L-configuration deoxyribonucleoside analogs from the 3' termini of DNA. J Biol Chem, 2000, 275: 31009-31015.

( 收稿日期: 2009-01-09

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