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免疫清除期相同肝实质细胞体积分摊的血清HBV DNA载量与肝组织炎症分级的关系
http://www.ganbingzixun.com     点击数:1452     更新时间:2010-08-03    【查看评论
李学俊 谢仕斌 张晓红 张英 赵志新 柯伟民 高志良

【摘要】目的   阐明慢性乙型肝炎自然病程中免疫清除期相同肝实质细胞体积分摊的血清 HBV DNA 载量水平与肝组织炎症分级的关系。 方法   使用荧光多聚酶链反应分别检测和比较慢性乙型肝炎免疫清除期患者肝组织病理炎症分级 1 2 3 4 级的血清 HBV DNA 载量 , 以及肝组织炎症分级 1 2 3 4 级所在肝纤维化分期用相同肝实质细胞体积分摊的血清 HBV DNA 载量。多组资料两两比较采用 ANOVA 检验分析。 结果   176 例处于免疫清除期慢性乙型肝炎患者肝组织病理学炎症分级 1 2 3 4 级血清 HBV DNA 载量分别为( 8.20 × 105 ± 9.11 × 101 )拷贝 /ml 、( 1.36 × 106 ± 5.96 × 101 )拷贝 /ml 、( 8.12 × 105 ± 8.01 × 101 )拷贝 /ml 和( 2.08 × 106 ± 3.69 × 101 )拷贝 /ml ,差异无统计学意义( P>0.05) 。然而,肝组织病理炎症 1 2 3 4 级所在肝纤维化分期用相同肝脏实质细胞体积分摊后的血清 HBV DNA 载量分别为( 9.24 × 108 ± 9.35 × 102 )拷贝 /ml 、( 5.33 × 109 ± 7.56 × 102 )拷贝 /ml 、( 1.06 × 1010 ± 1.77 × 103 )拷贝 /ml 、( 3.31 × 1011 ± 5.18 × 102 )拷贝 /ml ,差异有统计学意义( P<0.05 )。 结论   HBV 感染的自然病程中,从免疫耐受期进入免疫清除期后,肝细胞反复出现炎症,坏死,同时伴纤维组织增生。不同肝纤维化分期中相同肝实质细胞体积分摊的血清 HBV DNA 载量水平与肝组织炎症分级有关。

【关键词】肝炎,乙型,慢性; HBV DNA 载量; 免疫清除期; 肝实质细胞体积; 炎症分级; 发病机制

 

Association between the serum HBV DNA loads normalized to hepatic parenchyma cell volume and the liver histopathologic inflammation gradings in the immune clearance phase    LI Xue-jun, XIE Shi-bin, ZHANG Xiao-hong, ZHANG Ying, ZHAO Zhi-xin, KE Wei-min , GAO Zhi-liang. Department of Infectious Diseases, the Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University,   Guangzhou 510630,   China

Corresponding author: KE Wei-min, Email: kwm1999@163.com

Abstract Objective     To investigate the relationship between the serum HBV DNA loads normalized to hepatic parenchyma cell volume and the liver histopathologic inflammation gradings in the immune clearance phase during the natural history of hepatitis B. Methods     Serum HBV DNA loads were deteted by fluorescence polymerase chain reaction and normalized to hepatic parenchyma cell volume. The association between normalized HBV DNA loads and liver inflammation histopathologic grade were analyzed. Results     The secrum HBV DNA loads in patients with liver inflammation histopathologic grading 1, 2, 3 and 4 were 8.20 × 105 ± 9.11 × 101, 1.36 × 106 ± 5.96 × 101, 8.12 × 105 ± 8.01 × 101 and 2.08 × 106 ± 3.69 × 101 copies/ml, respectively (P > 0.05). But the secrum HBV DNA loads normalized to hepatic parenchyma cell volume in their located fibrosis stage were 9.24 × 108 ± 9.35 × 102, 5.33 × 109 ± 7.56 × 102, 1.06 × 1010 ± 1.77 × 103 and 3.31 × 1011 ± 5.18 × 102 copies/ml, respectively (P < 0.05). Conclusion     The serum HBV DNA load normalized to hepatic parenchyma cell volume in patients with different fibrosis stages is associated with liver histopathologic inflammation gradings.

Key words Hepatitis B, chronic;   HBV DNA load;   Immune clearance phase;   Hepatic parenchyma cell volume;   Inflammation grading;   Pathogenesis

HBV 慢性感染从免疫耐受期进入免疫清除期后,在针对 HBV 特异细胞毒性 T 淋巴细胞的作用下,肝细胞不断出现炎症、点状或桥状坏死,同时伴肝星状细胞的活化,启动肝间质的肝纤维化 [1-2] 。尽管有报道显示肝细胞内 HBV DNA 载量与血清 HBV DNA 载量呈正相关, HBV 慢性感染基线的 HBV DNA 载量水平与肝硬化和肝癌等并发症的发生率密切相关 [3-5] 。也有报道显示慢性乙型肝炎血清 HBV DNA 载量与肝组织病理炎症分级和肝纤维化分期无关 [6-7] 。为此,我们试图弄清肝纤维化 0 1 2 3 4 期相同肝实质细胞体积所分摊血清 HBV DNA 载量的水平是否与肝组织病理学炎症分级有关。

资料与方法

1. 患者资料 : 176 例处于免疫清除期( HBeAg 阳性)的慢性乙型肝炎患者为中山大学附属第三医院感染科 2005 1 -2008 12 月住院者。所有患者没有使用过核苷类似物、干扰素和胸腺素等抗病毒药物,排除抗病毒药物对 HBeAg 状态和 HBV DNA 载量的影响。此外,所有患者还使用酶联免疫吸附的方法检测甲、丙、丁和戊型肝炎病毒的标志物,排除重叠甲、丙、丁和戊型肝炎病毒感染对 HBeAg 系统状态和 HBV DNA 载量的影响。

2. 嗜肝病毒血清标志物的检测 : -HAV-IgM ,抗 -HAV-IgG 的诊断试剂盒购自北京科卫临床诊断试剂有限公司。 HBsAg 、抗 -HBs HBeAg 、抗 -HBe 、抗 -HBc 诊断试剂盒购自深圳华康生物工程有限公司。抗 -HCV-IgM 、抗 -HCV-IgG 诊断试剂盒购自中山生物工程有限公司。抗 -HEV-IgM 、抗 -HEV-IgG 的诊断试剂盒购自美国 Genelabs Technologies 公司。采用酶联免疫吸附 (ELISA) 法进行检测。所有血清的收集、储存、检测和结果的判断按照试剂说明书进行。

3. HBV DNA 检测 : HBV DNA 载量测定试剂购自中山大学达因基因公司,采用荧光聚合酶链反应。检测下限为 1000 拷贝 /ml

4. 肝组织病理检查、肝纤维化分期和肝纤维化面积的测量 : 肝组织病理标本的采集,用 Esaote Au4 型彩色多普勒机做引导,使用其配套的 16G 活检枪进行肝活组织检查,切割长度约 20mm 肝组织,用 Bouin s 液固定和石蜡包埋,分别用苏木素 - 伊红( HE )染色和 Masson 法网状纤维染色。由负责病理检查的医师根据 Desmet VJ 慢性肝炎的分类进行肝组织病理炎症分级和肝纤维化分期。然后,采用 JVCKY-F30B-CCD 摄像头, Zeiss Axieotron 显微镜, Kontron IBAS2.5 全自动图像分析系统把肝组织病理切片的图像放大到 400 倍,在肝组织病理标本的四角和中间选取 5 个视野进行平均得到肝纤维化面积百分比;相对应地,用扫描视野图像面积减去肝纤维化面积的百分比就可得到肝实质细胞面积的百分比。

5. 肝纤维化 0 4 期肝实质细胞体积的推算 [8]: 根据肝纤维化 0 1 2 3 4 期肝活组织标本 Masson 法网状纤维染色组织病理的全自动图像分析系统扫描得到肝纤维化 0 1 2 3 4 期时肝纤维化面积的百分比;相对应地,用扫描视野图像面积减去肝纤维化面积的百分比就可得到肝实质细胞面积的百分比。

再根据显微镜的视野原理,肝纤维化 0 1 2 3 4 期视野的 100% 圆形面积分别为肝纤维化 0 1 2 3 4 期肝实质细胞面积加上肝纤维化 0 1 2 3 4 期肝纤维化面积;由此可以推理,肝纤维化 0 1 2 3 4 期视野的 100% 圆形面积分别为小圆形的纤维化 0 1 2 3 4 期肝实质细胞面积加上包绕小圆形的半月形纤维化 0 1 2 3 4 期肝纤维化面积。那么,肝纤维化 0 1 2 3 4 期的肝实质细胞面积分别为肝纤维化 0 1 2 3 4 期视野的 100% 圆形面积减去肝纤维化 0 1 2 3 4 期肝纤维化面积。

又根据数学公式 : 圆形面积( A = 圆周率(π)×半径平方( R2 )[ A= π× R2 ];所以 , 肝纤维化 0 1 2 3 4 期肝实质细胞小圆形的半径( R )分别 = 小圆形面积( A )除以圆周率(π)商的平方根[ R= A/ π]。

按照病理组织的切片原理,等于通过视野的立体旋转,再根据数学公式,球形体积的计算公式 : 体积( V =4/3 圆周率(π)×半径立方( R3 )[ V=4/3 π× R3 ],所以,肝纤维化 0 1 2 3 4 期的肝实质细胞体积的百分比例分别 =4/3 π×肝纤维化 0 1 2 3 4 期肝实质细胞小圆形半径的立方( R3 )。推理和计算过程见图 1

6. 统计学处理 : 使用 SPSS11 0 统计软件,多组资料的两两比较采用 ANOVA 检验进行分析, P 0.05 为差异有统计学意义。

   

1. 176 例患者肝组织病理学检测结果:在 176 例处于免疫清除期的慢性乙型肝炎患者中,肝组织病理炎症分级 1 33 例,年龄( 29.48 ± 6.03 )岁(其中,肝纤维化 0 10 例、 1 23 例);炎症分级 2 58 例,年龄( 30.50 ± 7.01 )岁(其中,肝纤维化 0 2 例、 1 27 例、 2 17 例、 3 10 例、 4 2 例);炎症分级 3 61 例,年龄( 33.49 ± 8.20 )岁(其中,肝纤维化 1 7 例、 2 13 例、 3 26 例、 4 15 例);炎症分级 4 24 例,年龄( 32.96 ± 6.84 )岁(其中,肝纤维化 2 2 例、 3 3 例、 4 19 例)。

2. 免疫清除期肝组织相同病理炎症分级不同肝纤维化分期的病例分布及分摊的肝实质细胞体积百分比见表 1 (略)。

3. 免疫清除期肝组织病理炎症分级 1 4 级血清、以及由相同肝实质细胞体积分摊的 HBV DNA 载量动态见表 2

4. 免疫清除期肝组织炎症 1 4 级患者血清 HBV DNA 水平和相同肝实质细胞体积分摊的 HBV DNA 载量水平的动态统计分析见表 3

5. 肝纤维化 0 4 期肝实质细胞体积:肝纤维化 0 1 2 3 4 期时肝纤维化面积的百分比分别为 8.26% ± 2.41% 8.31% ± 2.90% 11.43% ± 2.76% 14.97% ± 5.88% 20.73% ± 4.44% ;肝实质细胞面积的百分比,分别为 91.79% 91.69% 88.57% 85.03% 79.27% ;肝实质细胞体积的百分比分别为 66.29% 66.07% 62.72% 59.00% 53.06%

   

婴幼儿或儿童期感染 HBV 由于Ⅰ型主要组织相容性复合物降低 HBsAg 特异的细胞毒性 T 淋巴细胞应答出现免疫耐受,免疫耐受期多持续 20 35 年,患者血清 HBeAg 阳性和高 HBV 复制,而 ALT 水平正常,肝组织几乎没有病理改变 [9] 。进入免疫清除期后,在细胞毒性 T 淋巴细胞的免疫介导下,表达 HBV 抗原的肝细胞发生凋亡,表现为 HBV DNA 载量波动, ALT 反复升高,肝组织炎症或坏死,部分患者可发生 HBeAg 血清转换,同时肝星状细胞被激活,导致肝内弥漫性的、过量的细胞外基质沉积,形成肝纤维化 [10-11] 。结果造成肝组织病理变化上同一炎症分级的患者中,可有不同的肝纤维化分期,不同的肝纤维化分期提供给 HBV 复制的肝细胞总数不一样,这将影响它们从肝细胞释放至血清中的 HBV DNA 总量,进而影响血清 HBV DNA 的载量水平。近年来,核苷类似物治疗慢性乙型肝炎取得快速的进展,血清 HBV DNA 载量水平,以及肝组织病理炎症分级是决定治疗方案的重要指标 [12-13] 。故此,弄清在不同肝组织病理炎症分级下相同肝实质细胞体积分摊血清 HBV DNA 载量水平是否有差异,将可阐明慢性乙型肝炎免疫清除期血清 HBV DNA 载量水平在反映肝组织病理炎症分级中的作用。

本研究的结果显示慢性乙型肝炎免疫清除期肝组织炎症分级四级之间两两比较没有差异。然而,在排除抗 HBV 药物和重叠其他嗜肝细胞病毒对 HBV DNA 载量水平影响的条件下,通过肝组织病理的图像分析,得到肝纤维化各期的肝实质细胞面积的百分比,再根据显微镜的视野原理和从圆形的面积到体积的数学推算,准确地计算出肝纤维化各期的肝实质细胞体积的百分比(推算过程见示意图 1 ),相当于提供给 HBV 复制的肝细胞场所的大小。进一步研究显示,同一肝组织病理炎症分级的不同肝纤维化患者由相同肝实质细胞体积百分比来分摊血清 HBV DNA 载量,得到肝组织炎症各级相同肝实质体积分摊的血清 HBV DNA 载量存在差异。由此可见,慢性乙型肝炎免疫清除期患者从血清 HBV DNA 载量推测肝组织炎症程度需要考虑该患者所处的肝纤维化分期的影响。本研究结果提示,在 HBV 慢性感染的自然病程中,从免疫耐受期进入免疫清除期后,肝细胞反复出现炎症、坏死,同时伴纤维组织增生。不同肝纤维化分期中相同肝实质细胞体积分摊血清 HBV DNA 载量的水平与肝组织病理炎症分级有关。

     

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