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乙型肝炎病毒转基因小鼠B7-H1表达水平与免疫耐受的相关性
http://www.ganbingzixun.com     点击数:1488     更新时间:2010-08-03    【查看评论
王卓轶 何江娟 耿磊 周琳 谢海洋 吴健 郑树森

  

【摘要】目的   探讨 HBV 转基因( Tg )小鼠脾脏树突状细胞( DC )及肝脏 B7-H1 表达水平与 HBV 免疫耐受的相关性。 方法   制备小鼠脾脏 DC ,混合淋巴细胞反应检测其同种抗原刺激能力,流式细胞仪检测 DC 表面主要组织相容性复合物 - Ⅱ( MHC- Ⅱ)及 CD80 CD86 B7-H1 等共刺激分子表达水平,酶联免疫吸附法检测白细胞介素 -2 IL-2 )、干扰素γ、 IL-10 水平,逆转录聚合酶链反应法和 Western blot 法检测肝组织 B7-H1 表达水平。计量数据组间比较采用 t 检验。 结果   DC T 淋巴细胞比例分别为 1 1 1 10 1 100 ,HBV Tg 小鼠脾脏 DC 刺激同种小鼠 T 淋巴细胞增殖数量(每分钟放射细胞数)分别为( 865.4 ± 39.3 )个、( 680.2 ± 34.8 )个和( 320.0 ± 12.7 )个,正常小鼠刺激同种小鼠 T 淋巴细胞增殖数量分别为( 22385.6 ± 99.7 )个、( 17850.6 ± 79.4 )个和( 760.0 ± 32.1 )个, HBV Tg 小鼠脾脏 DC 刺激同种小鼠 T 淋巴细胞增殖能力明显均弱于正常小鼠 DC t 值分别为 16.674 19.674 21.712 P 值均 <0.01 ,差异有统计学意义。同时 ,HBV Tg 小鼠 MHC- Ⅱ、 CD80 表达下调 , CD86 B7-H1 表达差异无统计学意义。 HBV Tg 小鼠分泌 IL-2 、干扰素γ、 IL-10 水平均降低,而 HBV Tg 小鼠和正常小鼠肝组织表达 B7-H1 的差异无统计学意义。 结论   HBV 免疫耐受与 MHC- Ⅱ、 CD80 下调表达导致的 HBV Tg 小鼠脾脏 DC 功能缺陷有关,而与负性共刺激分子 B7-H1 表达无关。                  

【关键词】肝炎病毒 , 乙型; 树突状细胞; B7-H1 免疫耐受

 

The study on the relationship between expression of B7-H1 on HBV transgenic mice and immune tolerance to HBV    WANG Zhuo-yi, HE Jiang-juan, GENG Lei, ZHOU Lin, XIE Hai-yang, WU Jian, ZHENG Shu-sen. Division of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, Department of Surgery, First Affiliated Hospital, School of Medicine, Zhejiang University, Key Laboratory of Combined Multi-organ Transplantation, Ministry of Public Health, Key Laboratory of Organ Transplantation, Zhejiang Province, Hangzhou 310003,China

Corresponding author: ZHENG Shu-sen, Email: shusenzheng@zju.edu.cn

Abstract Objective     To investigate whether there is an association between the expression of B7-H 1 in HBV transgenic mice and the immune tolerance to HBV. Methods     T cells stimulatory capacity of DC was analyzed using mixed lymphocyte reaction. Expression of MHC-II, CD80, CD86, B7-H1 on DC was detected by Flow Cytometry. IL-2, IFN γ , IL-10 production of T cells were determined by using ELISA. B7-H1 mRNA and protein expression in liver tissue were detected by RT-PCR and Western blotting respectively. Results     The ability of DC cells from HBV transgenic mice to stimulate T cell proliferation was significantly impaired compared with DC cells from control mice (t = 16.674, 19.674, 21.712, P < 0.01). Expression of MHC-II, CD80 on DC was markedly decreased in transgenic mice (t = 7.910, 6.413, P < 0.05). Meanwhile, the expression of CD86 and B7-H1 on DC cells in HBV transgenic mice were not significantly different from that   in control mice. The levels of IL-2, IFN γ , IL -10 in supernantant of T cells was significantly lower compared with controls (t = 18.712, 18.712 and 11.683, P < 0.05). There was no significant difference in B7-H1 expression at mRNA and protein levels in liver tissue compared with controls. Conclusions     Functional defeact of DC, partly due to decreased expression of MHC-II, CD80, but not related to B7-H1 expression, is the cause for immune tolerance to HBV in HBV transgenic mice.

Key words Hepatitis B virus;   Dendritic cells;   B7-H1;   Immune tolerance

慢性 HBV 感染时机体细胞免疫应答的削弱与树突状细胞( DC )功能的缺陷有密切关系 [1-2] DC 功能状况与其表面正性共刺激分子及负性共刺激分子表达水平密切相关 [3] 。慢性乙型肝炎时 DC 功能的缺陷与主要组织相容性复合物 - Ⅱ( MHC- Ⅱ)及表面共刺激分子如 CD80 CD86 表达下调有关 [4] ,但是否也存在负性共刺激分子如 B7-H1 的表达异常尚不清楚。慢性 HBV 感染时有库普弗细胞和肝窦内皮细胞功能的异常,而 B7-H1 可表达于库普弗细胞和肝窦内皮细胞表面,并负性调节其功能,故推测 B7-H1 可能是慢性 HBV 感染时库普弗细胞和肝窦内皮细胞功能异常的原因之一 [5-6] 。因此,我们进行了相关实验研究。

材料与方法

一、材料

HBV 转基因( transgenic Tg )小鼠 C57BL/6J TgN A1b1HBV 44Bri HBV 购于北京大学医学部。该鼠是 1998 2 月从美国 Jackson 实验室引进的,其转入的基因源于 HBV ayw 亚型,所转移的基因片段是编码 HBsAg S 基因、 preS 基因、 X 基因。同时于浙江省实验动物中心购买同系正常 C57BL/6J 小鼠, 6 8 周龄,清洁级环境中饲养。于浙江省实验动物中心购买 BALB/c 小鼠用于混合淋巴细胞反应。

二、方法

1. 脾脏 DC 的制备:将小鼠颈椎脱臼处死, 75% 乙醇浸泡 2min 后开腹取脾,置于 200 目不锈钢网上,剪刀剪碎后用注射器针芯轻轻捻抹脾脏组织,磷酸盐缓冲液( PBS )制备脾细胞悬液。红细胞裂解液破解红细胞后,用含 10% 胎牛血清 RPMI 1640 培养基重悬细胞, RPMI 1640 购自美国 Chemicon 公司。脾细胞悬液移入培养瓶中, 37 5% CO2 孵育 3h 后弃去悬浮细胞( T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞)。继续培养细胞 18h ,轻轻吹打细胞,收集悬浮细胞。

2. 单向混合淋巴细胞反应: BALB/c 小鼠脾脏 T 淋巴细胞作为反应细胞。尼龙膜过滤巨噬细胞和 B 淋巴细胞(可黏附于尼龙毛表面),因此可以分离 T 淋巴细胞;上述方法制备脾脏 DC 作为刺激细胞, RPMI 1640 调整 DC 浓度为 1 × 106/ml ,加入丝裂霉素 C 25 μ g/ml ), 37 5% CO2 孵育 30min RPMI 1640 洗涤 3 次以去除残留丝裂霉素 C 96 孔平底细胞培养板,调整刺激细胞分为: 1 × 106 /ml 1 × 105 /ml 1 × 104 /ml ,每孔 100 μ l ,设 3 个复孔。接种细胞后,水平转动 96 孔培养板,使细胞均匀混合。每孔加入反应细胞和刺激细胞各 100 μ l ,对照组包括单独反应细胞 100 μ l 和单独刺激细胞 100 μ l 以及空白对照。 37 5% CO2 孵育 6d ,结束反应前 18h 掺入 3H 胸腺嘧啶。最后多头细胞收集器将细胞收集到玻璃纤维滤纸上,烤箱内烘干。然后将载有细胞的滤纸放入盛有 2ml 闪烁液的计数瓶中 , β液闪测定仪计算每分钟放射细胞数。

3. 酶联免疫吸附法( ELISA )检测淋巴细胞分泌白细胞介素( IL -2 、干扰素γ( IFN γ)、 IL-10 水平: IL-2 IFN γ、 IL-10 单克隆抗体试剂盒购自美国 BD 公司,根据说明书步骤进行操作。配制包被缓冲液,用包被缓冲液 1 250 稀释包被抗体;每孔 100 μ l 加入酶标板, 4 孵育过夜,洗板 3 次(洗涤液:含 0.05% 吐温 -20 PBS );封闭:每孔加入 200 μ l 分析液,室温孵育 1h ;洗板 3 次;加样:每孔加入 100 μ l 的标准品、样品或质量控制样品,室温孵育 2h ;洗板 5 次;交联:每孔加入 100 μ l 的检测工作液(生物素标记的抗 IL-2 单克隆抗体 + 亲合素 - 辣根过氧化物酶连接物),室温孵育 1h ;洗板 7 次;显色:每孔加入 100 μ l 的显色底物,避光、室温孵育 30min 后,每孔加入 50 μ l 的终止液;于 30min 内读取吸光度值 A450nm 绘制标准曲线,求得样品浓度。

4. 流式细胞仪检测 DC 表面共刺激分子表达: 100 μ l DC 细胞悬液分别加入单克隆抗体: PEcy5-CD 11c ( 同型对照:美国仓鼠 IgG) FITC-MHC- ( 同型对照:小鼠 IgG 2a) PE-CD80 ( 同型对照:小鼠 IgG 2a) FITC-CD86 ( 同型对照:大鼠 IgG 2a) PE-B7-H1 ( 同型对照:大鼠 IgG 2a) 。上述抗体均购自美国 eBioscience 公司。室温孵育 20min PBS 洗涤 1 次后再用 200 μ l PBS 重悬,上机检测。

5. 逆转录聚合酶链反应( RT-PCR )法检测小鼠肝脏 B7-H1 mRNA 表达水平:根据试剂盒说明提取小鼠肝脏 RNA ,引物由上海生工生物技术公司合成,小鼠 B7-H1 上游引物为 5 -CTGCTTGCG TTAGTGGTGTA-3 ′,下游引物为 5 -CCTCGGCC TGACATATTAGT-3 ′。小鼠β - 肌动蛋白上游引物为 5 -AAAGATTCGTGAATGAC-3 ′,下游引物为 5 -TACAAGCACTTGCTTGTG-3 ′。

6. Western blot 法检测小鼠肝脏 B7-H1 蛋白表达水平:小鼠 B7-H1 Western blot 抗体购自美国 RD 公司。提取小鼠肝脏蛋白, l0% 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,电转移至聚偏氟乙烯膜上,含 5% 脱脂奶粉的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水( TBS )封闭 2h ,把膜放入 1 1000 稀释的第一抗体中,温和振荡 1h 4 )后置 4 冰箱中过夜。再温和振荡( 4 2h ,回收第一抗体后在含吐温 -20 TBS 缓冲液中洗膜 20min ,中间更换 TBS 2 3 次,分别把膜置于 1 2000 稀释的第二抗体(辣根过氧化物酶标记的抗兔 IgG )中温和振荡 1.5h ,在 TBS 中洗膜 15min ,曝光、显影及定影,通过凝胶成像系统读取目的条带的密度扫描值。

7. 统计学分析:采用 SPSS10.0 软件包,计量数据用均数±标准差( x- ± s ),组间比较采用 t 检验。

   

1. HBV Tg 小鼠和正常小鼠脾脏 DC 刺激同种小鼠 T 淋巴细胞增殖能力: DC T 淋巴细胞比例分别为 1 1 1 10 1 100 时, HBV Tg 小鼠脾脏 DC 刺激同种小鼠 T 淋巴细胞增殖数量 ( 每分钟放射细胞数 ) 分别为( 865.4 ± 39.3 )个、( 680.2 ± 34.8 )个和( 320.0 ± 12.7 )个,正常小鼠刺激同种小鼠 T 淋巴细胞增殖数分别为( 22385.6 ± 99.7 )个、( 17850.6 ± 79.4 )个和( 760.0 ± 32.1 )个, HBV Tg 小鼠脾脏 DC 刺激同种小鼠 T 淋巴细胞增殖能力明显均弱于正常小鼠 DC t 值分别为 16.674 19.674 21.712 P 值均 <0.01 ,差异有统计学意义。

2. HBV Tg 小鼠和正常小鼠脾脏 DC 刺激淋巴细胞分泌 IL-2 IFN γ、 IL-10 水平: HBV Tg 小鼠脾脏 DC 刺激 T 淋巴细胞分泌 IL-2 IFN γ、 IL-10 水平分别为( 525.3 ± 24.0 pg/ml 、( 584.1 ± 28.1 pg/ml 和( 128.1 ± 10.1 pg/ml ,正常对照小鼠分别为( 817.2 ± 45.5 pg/ml 、( 910.5 ± 30.3 pg/ml 和( 224.8 ± 12.0 pg/ml HBV Tg 小鼠脾脏 DC 刺激淋巴细胞分泌 IL-2 IFN γ、 IL-10 水平均较正常对照小鼠相应降低, t 值分别为 18.712 18.712 11.683 P 值均 <0.05 ,差异有统计学意义。

3. HBV Tg 小鼠和正常小鼠脾脏 DC 表面 MHC- Ⅱ及共刺激分子 CD80 CD86 B7-H1 表达: HBV Tg 小鼠和正常小鼠脾脏 DC MHC- Ⅱ表达分别为 25.0 ± 1.3 50.0 ± 2.3 CD80 表达分别为 20.0 ± 1.2 41.0 ± 2.1, HBV Tg 小鼠 MHC- Ⅱ和 CD80 表达下调, t 值分别为 7.910 6.413 P 值均 <0.05 ,差异有统计学意义。 CD86 表达分别为 64.0 ± 3.3 60.0 ± 3.2 B7-H1 表达分别为 97.0 ± 3.4 95.0 ± 3.8 t 值分别为 0.912 2.782 P 值均 >0.05 ,两组小鼠 CD86 B7-H1 表达,差异无统计学意义。

4. HBV Tg 小鼠和正常小鼠肝脏组织 B7-H1 表达情况: HBV Tg 小鼠和正常小鼠肝脏组织 B7-H1 mRNA 表达分别为 1.147 ± 0.026 1.128 ± 0.031 t 0.939 P>0.05 ,差异无统计学意义,见图 1 HBV Tg 小鼠和正常小鼠肝脏组织 B7-H1 蛋白表达分别为 0.426 ± 0.079 0.408 ± 0.065 t 0.352 P>0.05 ,差异无统计学意义,见图 2

   

虽然慢性乙型肝炎的发病机制尚未完全阐明,但细胞免疫缺陷是宿主不能有效完全清除 HBV 的主要原因。 DC 作为专职抗原提呈细胞在激发和协调细胞免疫反应上发挥关键作用。慢性 HBV 感染时机体细胞免疫应答的削弱与 DC 功能的缺陷有密切关系。慢性乙型肝炎患者 DC 表面 CD80 CD86 CD 1a HLA- Ⅱ类分子表达和 DC 培养上清液 IL-12 水平明显低于正常人。经 HBsAg 疫苗免疫后,患者血清 IL-12 水平和 DC 表达 CD80 CD86 均上调 [7] 。本研究结果显示 HBV Tg 小鼠脾脏 DC 刺激同种 T 淋巴细胞增殖能力较正常小鼠 DC 明显减弱,同时 T 淋巴细胞分泌细胞因子谱也发生了变化, IL-2 IFN γ、 IL-10 水平降低。 DC 表型显示 MHC- Ⅱ和共刺激分子 CD80 下调,这可能是 DC 功能缺陷的原因之一,因为, DC 的功能依赖于 MHC- Ⅱ和共刺激分子 CD80 CD86 等的表达水平。由于负性共刺激分子对免疫的负性调节功能,我们也探讨了 DC 功能缺陷是否也有负性共刺激分子失常表达。 B7-H1 是新近发现的负性共刺激分子通路,在体外能刺激 T 淋巴细胞分泌大量 IL-10 ,并能抑制活化 T 淋巴细胞的增殖 [8] ;大量研究表明 B7-H1 通路在负调 T 淋巴细胞免疫反应和 DC 功能上发挥重要作用 [9-11] 。我们检测了 HBV Tg 小鼠 DC 表面 B7-H1 的表达水平,结果显示 HBV Tg 小鼠 DC 和正常小鼠 DC 表达,差异无统计学意义。

肝脏免疫细胞有效的发挥免疫机能对防御和清除入侵 HBV 有重要作用。肝脏枯否细胞、 DC 、肝窦内皮细胞等非实质细胞是肝脏发挥免疫功能的细胞基础 [12] 。作为抗原提呈细胞库普弗细胞和肝窦内皮细胞既可表达 B7-1 B7-2 、细胞间黏附分子 -1 以有效活化 T 淋巴细胞增殖,刺激其分泌细胞因子,也可诱导 T 淋巴细胞免疫耐受,慢性乙型肝炎时有枯否细胞、肝窦内皮细胞功能的失常,而 B7-H1 又有负性调节枯否细胞、肝窦内皮细胞功能的作用 [13] 。我们探讨了 HBV Tg 小鼠肝脏 B7-H1 表达水平,结果显示在 mRNA 和蛋白水平皆无明显差异,因此,我们认为不论是作为专职抗原提呈细胞的 DC ,还是兼职抗原提呈细胞的库普弗细胞、肝窦内皮细胞,其对 HBV 的免疫耐受,均不通过改变 B7-H1 的表达水平来实现。

尽管 HBV Tg 小鼠能模拟慢性乙型肝炎时 HBV 的持续复制状态,但和慢性乙型肝炎相比仍存在很多不同之处。( 1 )患者的慢性感染是 HBV 病毒自然入侵,继而造成肝脏慢性炎症。( 2 )人类的 HBV 感染有几个不同的阶段,包括免疫耐受期、慢性乙型肝炎期和非活动性或无症状 HBV 携带期、康复期。( 3 )人类患者宿主和病毒之间的免疫更复杂。因此,有必要进一步探讨 HBV 慢性感染患者 DC 功能状况与 B7-H1 表达以及肝脏 B7-H1 表达水平。

     

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