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肝星状细胞诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化的体外研究
http://www.ganbingzixun.com     点击数:1688     更新时间:2010-08-03    【查看评论
陈琳 陈孝平 张伟 梁慧芳 林有智 董汉华 周巧丹

  

【摘要】目的   研究肝星状细胞 (HSC) 在体外培养的卵圆细胞向成熟肝细胞分化过程中所起的作用。 方法   1 )将卵圆细胞分别与原代培养的 HSC 混合共培养(混合共培养组),采用 Millicell 小室不接触共培养(不接触共培养组),卵圆细胞单独培养作为对照组。在共培养后第 7 14 21 天观测,采用 Western blot 和荧光定量 PCR 检测肝细胞核因子 4 α( HNF-4 α)、白蛋白和甲胎蛋白( AFP )、细胞角蛋白 19 CK-19 )的表达量;( 2 )电子透射显微镜观察卵圆细胞超微结构的变化;( 3 )过碘酸希夫染色检测各时间点卵圆细胞内糖原颗粒的含量;( 4 )酶联免疫吸附法检测各时间点卵圆细胞分泌白蛋白的含量。统计学处理采用重复测量资料的多因素方差分析和 LSD-t 检验。 结果   1 )卵圆细胞第 7 14 21 天表达 HNF-4 α和白蛋白的 mRNA 的量(相对与共培养之前的表达量的倍数):混合共培养组 HNF-4 α分别为( 1.9 ± 0.2 )倍、( 10.7 ± 1.2 )倍、( 12.0 ± 1.3 )倍;白蛋白 mRNA 的量分别为( 5.7 ± 1.6 )倍、( 110.7 ± 13.7 )倍、( 173.6 ± 22.3 )倍;不接触共培养组 HNF-4 α分别为( 1.4 ± 0.1 )倍、( 3.2 ± 0.6 )倍、( 8.9 ± 1.4 )倍;白蛋白 mRNA 的量分别为( 2.9 ± 1.4 )倍、( 22.3 ± 8.5 )倍、( 96.3 ± 16.3 )倍。共培养组(混合共培养与不接触共培养组)的表达量均高于对照组, LSD-t 值分别为 32.98 10.08 13.38 7.96 P 值均 <0.01 ,差异有统计学意义。第 7 14 21 AFP CK-19 的表达量:混合共培养组 AFP 分别为( 1.1 ± 0.2 )倍、( 0.2 ± 0.0 )倍、( 0.0 ± 0.0 )倍; CK-19 分别为( 0.2 ± 0.1 )倍、( 0.0 ± 0.0 )倍、( 0.0 ± 0.0 )倍;不接触共培养组 AFP 分别为( 1.0 ± 0.2 )倍、( 0.2 ± 0.1 )倍、( 0.1 ± 0.0 )倍; CK-19 分别为( 0.6 ± 0.1 )倍、( 0.1 ± 0.0 )倍、( 0.0 ± 0.0 )倍。共培养组(混合共培养与不接触共培养组)的表达量均低于对照组。 LSD-t 值分别为 37.99 34.50 13.59 22.46 P 值均 < 0.01 ,差异有统计学意义。( 2 )卵圆细胞共培养后白蛋白分泌量明显增加:混合共培养组: 14d 为( 15.30 ± 0.09 ng/ml 21d 20.98 ± 0.12 ng/ml ;不接触共培养组 14d 为( 11.41 ± 0.13 ng/ml 21d 为( 15.12 ± 0.17 ng/ml ,混合共培养组高于不接触共培养组, LSD-t 251.94 P<0.01 ,差异有统计学意义。( 3 )随着共培养时间的延长,卵圆细胞内质网、线粒体和高尔基体等细胞器逐渐丰富,且细胞间形成毛细胆管结构。( 4 )过碘酸希夫染色显示共培养后卵圆细胞内出现大量红色糖原颗粒。 结论   HSC 可以诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化, HSC 除了通过细胞因子等可溶性因子途径发挥作用外,与卵圆细胞的直接接触也有着重要作用。

【关键词】肝细胞 ;   白蛋白类; 甲胎蛋白类 ;   肝星状细胞; 卵圆细胞

 

Differentiation of hepatic oval cell into mature hepatocyte induced by hepatic stellate cells     CHEN Lin, CHEN Xiao-ping, ZHANG Wei, LIANG Hui-fang, LIN You-zhi, DONG Han-hua, ZHOU Qiao-dan. Department of Hepatic Surgery, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

Corresponding author: CHEN Xiao-ping, Email: northwood001@126.com

Abstract Objective     To investigate the role of hepatic stellate cells in the differentiation of hepatic oval cells into adult hepatocyte. Methods     The oval cell were cocultured with primary hepatic stellate cells (HSC) in the same well (M-coculture) or separately cultured with HSC by millIcell (S-coculture). Oval cells were cultured alone as control; the expression of adult hepatocyte marker HNF-4 α , albumin, and oval cell marker AFP, CK -19 in each group were detected by real-time PCR and western-blot.   Phenotype changes were observed by transmission electron microscope (TEM); PAS staining was used to detect the quantity of glycogen granule in oval cell. Albumin level in supernatant was detected using ELISA kit. Result     (1) The relative level of HNF-4 α and albumin mRNA expression compared with pre-coculture: M-coculture:HNF-4 α : 1.9 ± 0.2, 10.7 ± 1.2, 12.0 ± 1.3; albumin: 5.7 ± 1.6, 110.7 ± 13.7, 173.6 ± 22.3. S-coculture: 1.4 ± 0.1, 3.2 ± 0.6, 8.9 ± 1.4 times; albumin: 2.9 ± 1.4, 22.3 ± 8.5, 96.3 ± 16.3. The relative level of HNF-4 α and albumin mRNA expression in coculture group (M- and S-colculture) were higher than control group (LSD-t: 32.98, 10.08, 13.38, 7.96; P < 0.01); and a higher level of HNF -4a and albumin was found in M-coculture group compared to S-coculture group (LSD-t: 32.98, 25.65; P < 0.01). The relative level of AFP and CK-19 mRNA expression compared with pre-coculture: M-coculture: 1.1 ± 0.2, 0.2 ± 0.0, 0.0 ± 0.0; S-coculture group: AFP: 1.0 ± 0.2, 0.2 ± 0.1, 0.1 ± 0.0; CK-19: 0.6 ± 0.1, 0.1 ± 0.0, 0.0 ± 0.0; control group: AFP: 1.0 ± 0.1, 1.0 ± 0.1, 1.1 ± 0.1, CK-19: 1.0 ± 0.1, 1.1 ± 0.1, 1.0 ± 0.1. The relative level of AFP and CK-19 mRNA expression in coculture group(M- and S-colculture) were lower than that in control group (LSD-t: 37.99, 34.50, 13.59, 22.46; P < 0.01). (2) The albumin secretion was detected in M-coculture: 14day: (15.30 ± 0.09) ng/ml, 21: (20.98 ± 0.12) ng/ml; S-coculture: 14 day: (11.41 ± 0.13) ng/ml, 21day:(15.12 ± 0.17) ng/ml. (3) It showed more organelles such as endoplasmic reticulum, mitochondrion and Golgi apparatus in oval cells cocultured with HSC. And cholangiole-like structure appeared between oval cells cocultured with HSC. (4) PAS staining showed glycogen granules could be observed in coculture groups. Conclusion     HSC can induce differentiation of oval cell into mature hepatocyte.

Key words Hepatocytes;   Albumins;   Alpha-Fetoproteins;   Hepatic stellate cells,     Hepatic oval cells

在理化因素及感染等造成肝损伤的情况下,成熟肝细胞增殖受抑制或不能满足肝功能的代偿要求时,卵圆细胞活化,增殖,分化成成熟肝细胞,参与肝再生 [1] 。在卵圆细胞增殖分化成为成熟肝细胞的过程中,其所处的肝脏微环境起到极为重要的调控作用 [2] 。肝星状细胞( HSC )是多种细胞外基质和细胞因子的重要来源,推测其在卵圆细胞向肝细胞分化的过程中起到重要的作用 [3] 。本实验探讨 HSC 对卵圆细胞向肝细胞定向分化的调控作用及机制。

材料与方法

1. 实验动物:雄性 SD 大鼠(华中科技大学同济医学院动物实验中心提供)体质量 300g 左右,常规饲料喂养,正常饮水。

2. HSC 的分离、培养和鉴定:参照文献 [4] 的方法略有修改。大鼠麻醉消毒后,下腔静脉门静脉插管,推注含肝素的预热的磷酸盐缓冲液( PBS 20ml/min ,待下腔静脉流出液变清,取下肝脏离体灌注 0.05% Ⅳ型胶原酶(购自美国 Sigma 公司) 20ml/min 15min 。剪碎肝脏,置于 0.05% Ⅳ型胶原酶中 37 振荡消化 15min 200 目筛网滤过。细胞悬液 50 × g 离心 10min 2 次,取上清液, 400 × g 离心 10min 0.08% 蛋白酶 E (购自美国 Sigma 公司)振荡消化 15min DMEM (购自美国 Gibco 公司)重悬细胞,将细胞悬液小心铺于已预制连续密度梯度( 28000 × g 离心 15min )的 25% Percoll (购自美国 Sigma 公司)上, 800 × g 离心 15min ,小心吸取上层细胞混浊带, PBS 400 × g 离心 10min 洗涤 1 遍,用含 10% 胎牛血清(购自美国 Hyclone 公司)的 DMEM 重悬细胞,显微镜下锥虫蓝染色测定细胞活力,并计数。按 2 × 105 个细胞 / cm2 接种于 1 次性 25cm 2 玻璃培养瓶。 30min 后将细胞悬液吸出,种于另一培养瓶。 24h 后换液,以后每 3d 换液 1 次。待细胞融合达到 80% 90% 时进行传代,传代时按常规使用 0.25% 胰酶。细胞贴壁 1 周后用相差显微镜( Nikon Digital ECLIPSE C1 型,购自日本 Nikon 公司),观察 HSC 形态,并采用免疫荧光鉴定 HSC 结蛋白(购自美国 NewMark 公司)效价 1 100 的表达情况。

3. 卵圆细胞 LE6 细胞系的培养: LE6 细胞由美国 Nelson Fausto 教授馈赠。细胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM 37 5% CO2 条件下培养,每 2 3d 换液,待细胞长满单层后用 0.25% 胰酶消化传代。

4. 试验分组:分为不接触共培养组,混合共培养组和对照组。分离共培养组时将 HSC 1 × 104 / 孔接种于 6 孔板底部,将卵圆细胞按 1 × 104 / 孔接种于 Millicell 小室(购自美国 Millipore 公司)中;混合共培养组,将 HSC 1 × 103 / 孔,卵圆细胞以 1 × 104 / 孔混合同时接种于 6 孔板中;卵圆细胞按 1 × 104 / 孔接种至 6 孔板作为对照。每 2 3d 换液 1 次。做电镜检查和细胞免疫荧光检测时将卵圆细胞传于预置有玻片的 6 孔板中。

5. RNA 的提取和逆转录:分别在共培养 7 14 28d 将细胞小心消化离心后加入 1ml Trizol Reagent (购自美国 Invetrogen 公司),提取总 RNA ,采用立陶宛 Fermentas 公司的 RT-PCR 试剂盒逆转录合成 cDNA ,严格按试剂盒说明书进行操作。取 0.1g 肝组织放入匀浆器中,加入 1ml Trizol Reagent 在冰上匀浆 30min ,抽取上清液提取总 RNA 并逆转录为 cDNA

6. 荧光定量 PCR 检测:肝细胞核因子 4 α( hepa-tocyte neclear factor-4 α , HNF-4 α)和白蛋白,细胞角蛋白 -19 cytokeratin-19 CK-19 ),甲胎蛋白( AFP )以及内参照β - 肌动蛋白(β -actin )的基因引物序列利用 Primer5.0 软件设计,解链温度均为 60 ,荧光定量 PCR 引物序列见表 1 。荧光定量 PCR 试剂盒购自美国 ABI 公司, 25 μ l 体系用 ABI Prism7000 荧光定量 PCR 仪(购自美国 ABI 公司)检测。利用比较 Ct 值法检测共培养前后卵圆细胞表达 HNF-4 α和白蛋白, CK-19, AFP 的表达情况。重复 3 次。

7. Western blot :分别在共培养前,共培养第 7 14 21d 收集各组卵圆细胞,取总蛋白 , 蛋白定量试剂盒(购自美国 Pierce 公司)测定各样本蛋白浓度,加样量为 100 μ g ,行十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳,电转蛋白到聚偏二氟乙烯膜(购自美国 Millipore 公司)上 , 转膜条件:β -actin 200mA 60min HNF-4 α : 200mA 70min ;白蛋白: 200mA 80min CK-19 200mA 60min AFP 200mA 80min 。用 5% 脱脂奶粉封闭 1h 后加第一抗体 4 孵育过夜。鸡抗大鼠白蛋白抗体购自英国 Abcam 公司,效价 1 500 ;山羊抗大鼠 HNF-4 α,小鼠抗大鼠 AFP 购自美国 Santa Cruz 公司,效价均为 1 500 ;小鼠抗大鼠细胞角蛋白 19 购自美国 Millipore 公司,效价 1 300 。洗膜后加第二抗体孵育 2h (羊抗鸡 IgG 购自北京博奥森公司,效价 1 300 ,兔抗山羊 IgG, 羊抗小鼠 IgG 购均自美国 Pierce 公司,效价 1 5000 ),增强化学发光试剂盒(购自美国 Pierce 公司)发光。独立试验重复 3 次。

8. 过碘酸希夫染色:共培养后 21d ,各组细胞爬片先经 75% 乙醇固定 10min 1% 过碘酸水溶液处理 10min ,蒸馏水洗 3 次,希夫试剂孵育 10min ,流水冲洗 10min ,光镜下观察。

9. 电镜形态学检查:共培养 21d 后,将卵圆细胞经 70% 戊二醛固定后常规包埋切片,采用透射电子显微镜( Tecnai G2 12 型,购自荷兰 FEI 公司)观察卵圆细胞的超微结构。

10. 酶联免疫吸附法检测白蛋白的分泌量:分别在共培养前,共培养第 7 14 21 天收集各组卵圆细胞,按 5 × 105 / 孔接种入 6 孔板,待细胞贴壁以后,将培养液换为 3ml 无血清培养液, 24h 后收集培养液上清液,采用酶联免疫吸附法试剂盒(购自美国 immunology consultants laboratory 公司)检测细胞上清液中的白蛋白含量,独立试验重复 3 次。

11. 统计学方法:各试验独立重复 3 次,每次 3 个样本。各统计结果采用均数±标准差( x- ± s )表示,利用 SPSS 软件进行统计,采用重复测量资料的多因素方差分析和 LSD-t 检验分析组间差别, P<0.05 为差异有统计学意义。

   

1. HSC 的鉴定:每只大鼠可获得 HSC 1.7 ± 0.4 )× 107 个,锥虫蓝拒染实验证实细胞存活率为 92.6% ± 2.3% ,接种入培养瓶后 24h 内全部贴壁,呈梭形,培养 1 周后细胞逐渐伸展呈星状多边形,免疫荧光显示细胞胞质强表达结蛋白。细胞纯度 94.2% ± 3.1% ,见图 1

2. 卵圆细胞 mRNA 的表达变化:( 1 )混合共培养组和不接触共培养组成熟 HNF-4 α表达量明显高于对照组, LSD-t 值分别为 32.98 10.08 P 值均 <0.01 ,差异有统计学意义。混合共培养组 HNF-4 α的表达量明显高于不接触共培养组, LSD-t 32.98 P<0.01 ,差异有统计学意义。( 2 )混合共培养组和不接触共培养组白蛋白的表达量明显高于对照组, LSD-t 值分别为 13.38 7.96, P<0.01 <0.05 ,差异有统计学意义。混合共培养组白蛋白 mRNA 表达量高于不接触共培养组, LSD-t 25.65 P<0.01 ,差异有统计学意义。( 3 )混合共培养组和不接触共培养组 AFP 的表量低于对照组, LSD-t 值分别为 37.99 34.50 P 值均 <0.01 ,差异有统计学意义。混合共培养组 AFP 的表达量则低于不接触共培养组, LSD-t 11.99 P<0.01 ,差异有统计学意义。( 4 )混合共培养组和不接触共培养组 CK-19 的表达明显低于对照组, LSD-t 值分别为 13.59 22.46 P 值均 <0.01 ,差异有统计学意义。混合共培养组 CK-19 表达量低于不接触共培养组, LSD-t 8.44 P<0.05 ,差异有统计学意义,见表 2

3. 细胞标志物蛋白的表达变化:( 1 )混合共培养和不接触共培养组成熟 HNF-4 α的表达量高于对照组, LSD-t 分别为 29.32 14.75 P 值均 <0.01 ,差异有统计学意义。同时,混合共培养组 HNF-4 α的表达量要高于不接触共培养组, LSD-t 9.17 P<0.05 ,差异有统计学意义。( 2 )混合共培养和不接触共培养组白蛋白的表达量高于对照组 LSD-t 分别为 25.74 42.42 P 值均 <0.01 ,差异有统计学意义;同时,混合共培养组白蛋白的表达量要高于不接触共培养组 LSD-t 13.52, P<0.01 ,差异有统计学意义。( 3 )混合共培养和不接触共培养组 AFP 的表达量均低于对照组, LSD-t 分别为 29.38 29.21 P 值均 <0.01 ,差异有统计学意义。而混合共培养组 AFP 的表达量要低于不接触共培养组, LSD-t 32.65 P 值均 <0.01 ,差异有统计学意义。( 4 )混合共培养和不接触共培养 CK-19 的表达量低于对照组。 LSD-t 分别为 21.41 19.31 P 值均 < 0.01 ,差异有统计学意义。而混合共培养组 CK-19 的表达量要低于不接触共培养组 LSD-t 30.33 P 值均 <0.05 ,差异有统计学意义,见图 2 ,表 3

4. 过碘酸希夫染色糖原染色观察结果:共培养 21d 后卵圆细胞胞浆中可见大量粗大红色糖原颗粒,而对照组过碘酸希夫染色呈阴性,混合共培养组和不接触共培养组之间,差异无统计学意义,见图 3

5. 电子显微镜观察结果:对照组卵圆细胞体积较小,直径在 7 10 μ m 左右 , 胞核大 , 胞质相对较少 , 核质比高 , 胞浆内细胞器较少,仅见少量内质网(图 4A );混合和不接触共培养 1 周后均可发现:卵圆细胞内细胞器明显增多,可见大量扩张内质网和丰富的线粒体(图 4B ; 混合和不接触共培养 3 周以后卵圆细胞胞浆内除内质网、线粒体外,还可见到丰富的高尔基体,提示卵圆细胞有分泌蛋白质的功能(图 4C )出现细胞间连接复合体,并形成胆小管样结构和微绒毛(图 4D )。

6. 卵圆细胞分泌白蛋白的浓度:共培养之前及对照组的细胞培养液上清液均未检测到白蛋白,共培养组在共培养 14d 后,细胞培养液上清液中出现白蛋白,混合共培养组( 15.30 ± 0.09 ng/ml ,不接触共培养组( 11.41 ± 0.13 ng/ml ;共培养 21d 后,细胞培养液上清液中白蛋白含量有所增加,混合共培养组( 20.98 ± 0.12 ng/ml ,不接触共培养组( 15.12 ± 0.17 ng/ml 。结果显示共培养后卵圆细胞获得了分泌白蛋白的功能。而且,混合共培养组的白蛋白分泌量要高于不接触共培养组( LSD-t 251.94 P 8.76e-006 )。

   

卵圆细胞有向成熟肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力,其分化的方向取决于周围微环境的影响。在 2-AAF/PH 卵圆细胞增殖模型中, HSC 与卵圆细胞在空间位置、增殖时间等方面有密切关系 [5] 。说明 HSC 可能对卵圆细胞的增殖分化产生影响。

本研究结果显示,与 HSC 共培养之后, HNF-4 α和白蛋白明显增加,而 AFP CK-19 则逐渐低表达。与之相应的是随着共培养时间的延长,卵圆细胞的形态也逐渐向成熟肝细胞变化,表现为核质比变小,细胞器丰富,细胞之间形成毛细胆管样结,缝隙连接和桥粒连接正是上皮细胞的特征。是细胞间出现毛细胆管样结构则是卵圆细胞向成熟肝细胞分化的一个直接证据 [6] 。共培养后的卵圆细胞也表现出成熟肝细胞特有的功能,如糖原合成和分泌白蛋白 [7] HSC 可以诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化。

由于不接触共培养组采用的 Millicell 小室的半透膜只允许可溶性分子通过,而细胞不能透过,提示 HSC 是通过其分泌的可溶性细胞因子影响卵圆细胞的分化。 HSC 可分泌多种细胞因子如肝细胞生长因子、酸性成纤维生长因子、表皮细胞因子及转化生长因子β,而卵圆细胞则表达上述细胞因子的受体 [3] 。肝细胞生长因子是一种重要的促进肝脏干细胞增殖的细胞因子,通过与细胞表面受体 c-Met 结合进而激活下游信号通路,并可促进卵圆细胞的增殖 , 并且有体外实验证实肝细胞生长因子可以定向诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化,酸性成纤维生长因子、表皮细胞因子等细胞因子联合使用可以定向诱导卵圆细胞向成熟肝细胞方向分化 [8-9] 。转化生长因子β具有诱导肝脏卵圆细胞凋亡,促进其分化的能力 [10] 。因此很有可能是 HSC 通过上述可溶性细胞因子,定向诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化,而抑制其向胆管上皮细胞分化。同时我们发现混合共培养组 HNF-4 α、白蛋白的表达量和白蛋白的分泌量均明显高于不接触共培养组,提示除了可溶性的细胞因子, HSC 可能通过细胞间的直接相互接触作用或通过其自身分泌的细胞外基质介导的相互作用,诱导卵圆细胞的分化,已有研究表明,将卵圆细胞接种于细胞外基质(Ⅰ型胶原等)包被的培养皿中,可促进卵圆细胞向成熟肝细胞分化 [9] 。也有体内实验证实细胞外基质层黏连蛋白和纤维连接蛋白与卵圆细胞的增殖和分化有密切的联系 [5]  

因此,肝脏干细胞可通过可溶性细胞因子及其分泌的细胞外基质定向诱导卵圆细胞向成熟肝细胞分化,而不向胆管细胞分化。尽管如此,在卵圆细胞分化过程中起决定作用的是可溶性的细胞因子而不是细胞间相互作用。由于 HSC 分泌细胞因子多种多样, HSC 与卵圆细胞直接相互作用叠加效果极为复杂,因此, HSC 具体通过上述何种途径或者是否有协同作用需要进一步实验加以证实。

     

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